致病性細(xì)菌感染對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅，特別是在慢性和急性傷口中，細(xì)菌的定植和生物膜的形成使得傷口愈合變得更加困難。基于活性氧（ROS）的療法具有廣譜抗菌活性和低耐藥性的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為一種治療感染創(chuàng)面的非抗生素策略。然而，其臨床應(yīng)用仍受限于給藥效率低、細(xì)菌靶向性差及治療后炎癥失控等問(wèn)題。

為此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種多功能雙層微針貼片（LFT/S-MN），旨在有效滅菌并促進(jìn)傷口愈合。該貼片將帶正電荷的乳鐵蛋白基納米粒子（LFT NPs）與卟啉聲敏劑（TAPPFe）結(jié)合，放置在可溶解的基底層中，同時(shí)在pH響應(yīng)的針尖層中加載抗炎藥物spermidine（SPD）。當(dāng)微針插入感染組織后，釋放的LFT NPs能夠有效靶向并聚集負(fù)電荷細(xì)菌，在超聲刺激下通過(guò)協(xié)同的化學(xué)動(dòng)力和聲動(dòng)力療法（CDT/SDT）生成大量的ROS。同時(shí)，傷口的酸性微環(huán)境觸發(fā)了針尖層的逐步降解，從而實(shí)現(xiàn)SPD的控制釋放，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。在銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）感染的小鼠傷口模型中，LFT/S-MN貼片顯著減少了細(xì)菌負(fù)荷，抑制了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了膠原蛋白沉積和新生血管形成，并加速了傷口閉合。

這項(xiàng)工作提出了一種有前景的非抗生素策略，通過(guò)協(xié)同的CDT/SDT和炎癥調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)傷口抗菌與組織再生。該微針貼片是利用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）技術(shù)（microArch® S240，精度：10 μm）3D打印加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成，相關(guān)研究成果以“Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing"為題發(fā)表在期刊《Journal of Controlled Release》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院2023級(jí)博士研究生姜鵬為論文作者，黎威教授為論文通訊作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院為論文完成單位，以上研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和武漢大學(xué)泰康生命醫(yī)學(xué)中心PI經(jīng)費(fèi)的支持。

如圖1所示，該貼片在可溶解基層中集成了與卟啉聲敏劑（TAPPFe）偶聯(lián)的帶正電荷的乳鐵蛋白納米顆粒（LFT NP），以及負(fù)載抗炎劑亞精胺（SPD）的pH響應(yīng)尖層。插入感染組織后，釋放的 LFT NP 有效地靶向并聚集帶負(fù)電荷的細(xì)菌，從而在超聲刺激下通過(guò)協(xié)同化學(xué)動(dòng)力學(xué)和聲動(dòng)力學(xué)療法（CDT/SDT）產(chǎn)生強(qiáng)大的 ROS。同時(shí)，酸性傷口微環(huán)境觸發(fā)尖層的逐漸降解，可控的SPD 釋放以進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。在銅綠假單胞菌感染的小鼠傷口模型中，LFT/S-MN 貼片顯著降低了細(xì)菌載量，抑制了炎癥，促進(jìn)了膠原蛋白沉積和新生血管形成，并加速了傷口閉合。

圖1. LFT/S-MN貼片治療感染傷口的結(jié)構(gòu)和治療機(jī)制示意圖。（A）雙層LFT/S-MN貼片的設(shè)計(jì)和制備是由負(fù)載正電荷LFT NPs的可溶基底層和封裝SPD的pH響應(yīng)尖層組成。（B）插入感染創(chuàng)面后，基底層迅速溶解釋放LFT NPs， LFT NPs積極靶向帶負(fù)電荷的細(xì)菌，并通過(guò)協(xié)同SDT和CDT在US下產(chǎn)生ROS，實(shí)現(xiàn)有效的細(xì)菌除去。同時(shí)，酸性傷口微環(huán)境觸發(fā)尖層降解，導(dǎo)致SPD持續(xù)釋放，用于炎癥調(diào)節(jié)。這種聯(lián)合策略促進(jìn)細(xì)菌清除、免疫調(diào)節(jié)和組織再生，最終加速傷口愈合。

為了實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性和控制藥物釋放，使用順序成型策略制備了pH響應(yīng)雙層MN貼片，稱為L(zhǎng)FT/S-MN貼片。為了可視化和結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，兩個(gè)熒光探針，羅丹明B標(biāo)記的牛血清白蛋白（RhB-BSA）和異硫氰酸熒光素（FITC），分別裝載到納米顆粒的尖和基底層（圖2A和B）。尖層是通過(guò)紫外誘導(dǎo)自由基聚合和甲基丙烯酸殼聚糖（CSMA）與SPDTA之間的席夫堿交聯(lián)合成的，基底層由18 wt%的聚乙烯醇（PVA）和蔗糖溶液組成，背襯層由20 wt%的聚苯乙烯（PS）組成。能量色散X射線能譜（EDS）分析（圖2C）表明，來(lái)自LFT NPs的鐵元素分布均勻，局限于基底層，而尖層的碳元素分布均勻，表明明顯的空間分離。得到的LFT/S-MN貼片由一個(gè)10 × 10 MN陣列組成，跨度約0.5 cm2（圖2D）。每根針都具有明確的圓錐形形態(tài)，高度約850 μm，具有明顯的雙層結(jié)構(gòu)（圖2E和F）。力學(xué)測(cè)試顯示，每根針的斷裂力約為4N（圖2G），足以實(shí)現(xiàn)有效的經(jīng)皮插入和潛在的臨床應(yīng)用。

圖2. LFT/S-MN貼片的表征。（A-B）LFT/S-MN貼片的代表性明場(chǎng)和熒光圖像，說(shuō)明了摻入成分的結(jié)構(gòu)完整性和熒光標(biāo)記。（C）能譜圖證實(shí)了MNs內(nèi)元素的分布。（D）光學(xué)圖像和（E, F）SEM圖像顯示LFT/S-MNs的形貌。黃色虛線表示ph響應(yīng)尖層和可溶解基層之間的界面。（G）LFT/S-MNs的力-位移曲線，表明其機(jī)械強(qiáng)度適合皮膚穿透。

采用離體豬皮評(píng)價(jià)LFT/S-MN貼片的皮膚穿透能力。應(yīng)用后，MNs成功突破角質(zhì)層，并將封裝的熒光染料輸送到皮膚中，熒光成像顯示（圖3A），組織學(xué)橫截面證實(shí)（圖3B）。通過(guò)熒光顯微鏡觀察LFT NPs的溶出行為和隨后的釋放。如圖3C所示，基層在80秒內(nèi)溶解在PBS（pH 7.4）中，促進(jìn)LFT NPs從MN基中快速釋放?？紤]到感染的傷口微環(huán)境通常是酸性的，作者進(jìn)一步研究了MN尖的pH響應(yīng)行為。體外釋放研究表明，尖層在輕度酸性條件下（pH 5.6）逐漸降解，到第15天幾乎分解，而在中性條件下（pH 7.4）發(fā)生最小降解（圖3D），表明尖層的酸敏感行為。定量測(cè)定藥物裝載和遞送效率（圖3E和F）。LFT為145.43 ± 2.76 μg，SPD為14.96 ± 0.08 μg。經(jīng)皮膚給藥后，LFT經(jīng)MNs給藥量為132.83 ± 2.91 μg，SPD經(jīng)MNs給藥量為14.38 ± 0.22 μg，兩種藥物的給藥效率均超過(guò)90%。此外，SPD在酸性條件（pH 5.6）下的累積釋放量在第15天達(dá)到88.87 ± 3.58%，顯著高于PBS（pH 7.4），進(jìn)一步證實(shí)了MN尖的酸響應(yīng)釋放譜（圖3G）。

圖3. LFT/S-MN貼片的藥物釋放評(píng)價(jià)。（A）LFT/S-MN貼片植入后豬離體皮膚的代表性亮場(chǎng)和熒光顯微鏡圖像。（B）MN貼片植入后的豬皮膚組織學(xué)切片。（C）光學(xué)圖像顯示了80秒內(nèi)PBS中基底層的快速溶解和尖層的分離。（D）倒置熒光顯微鏡圖像顯示在不同pH條件下（pH 7.4和5.6），模擬中性和輕度酸性傷口環(huán)境下，MN在15天內(nèi)降解。（E） LFT/S-MN貼片LFT裝載和遞送的量化。（F） LFT/S-MN貼片SPD裝載和遞送的量化。（G） LFT/S-MNs中SPD隨時(shí)間的體外累積釋放曲線。數(shù)據(jù)以mean ± SD表示（n = 3個(gè)獨(dú)立樣本）。

作者系統(tǒng)評(píng)價(jià)了LFT/S-MN貼片的體外抗菌效果。如圖4D所示，超聲照射（3 MHz, 0.97 W/cm2，50%占空比，30 min）下LFT的最小抑制濃度（MIC）為128 μg/mL。單獨(dú)的LFT/S-MN貼片表現(xiàn)出中等的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為36.41 ± 0.75%，對(duì)銅綠假單胞菌的抑制率為35.87 ± 1.48%（圖4A和E）。相比之下，超聲波激活后，LFT/S-MN貼片的抑菌率顯著提高，分別為99.95 ± 0.04%和99.96 ± 0.04%（圖4E），表明細(xì)菌幾乎失活。SYTO 9/PI染色進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)果，其中LFT/S-MN US組顯示出主要的紅色熒光，表明廣泛的細(xì)菌死亡（圖4B和F）。掃描電鏡（SEM）提供了額外的形態(tài)學(xué)證據(jù)；未處理組的細(xì)菌保持了完整和光滑的膜，而暴露于超聲激活的LFT/S-MN的細(xì)菌則表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)破壞和膜破裂（圖4C）。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，超聲激活后，LFT/S-MN貼片可以產(chǎn)生大量的局部ROS，從而在病變部位有效地消滅細(xì)菌。

圖4. LFT/S-MN貼片體外抗菌性能研究。（A）瓊脂板的代表性照片，顯示LFT/S-MNs對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抗菌效果。（B）熒光顯微鏡圖像顯示金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在不同處理?xiàng)l件下產(chǎn)生ROS引起的氧化應(yīng)激。（C）處理后細(xì)菌形態(tài)的SEM圖像，顯示金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的膜破壞和結(jié)構(gòu)變形。（D）LFT在LFT/S-MNs中對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度（MIC），顯示出劑量依賴性的抗菌活性。紅色箭頭表示LFT的MIC值。（E）不同處理后細(xì)菌活力的定量分析，通過(guò)活/死染色評(píng)估。（F）活/死實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)的綠色熒光強(qiáng)度（FI）測(cè)量結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了抗菌作用。數(shù)據(jù)顯示以mean ± SD（n = 3個(gè)獨(dú)立樣本）。** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示無(wú)顯著性。

為了驗(yàn)證LFT/S-MN貼片的體內(nèi)治療效果，作者利用銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）建立小鼠皮膚創(chuàng)面感染模型（圖5A）。將感染小鼠隨機(jī)分為8組（每組n = 5），包括非超聲組（Blank、S-MN、LF/S-MN、LFT/S-MN）和超聲處理組（Blank+US、S-MN+US、LF/S-MN+US、LFT/S-MN+US）。超聲方案包括3 MHz每日照射，0.97 W/cm2，50%占空比，30分鐘，連續(xù)3天。在治療后第0、1、3、5和9天通過(guò)拍照監(jiān)測(cè)傷口進(jìn)展（圖5B）。第1天，LFT/S-MN+US組膿性滲出明顯減少，反映了CDT和SDT的聯(lián)合抗菌作用。相比之下，非超聲組表現(xiàn)出更廣泛的膿毒和炎癥。第3天，超聲給藥完成后，收集傷口床樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，評(píng)估殘余細(xì)菌負(fù)荷（圖5E）。平板計(jì)數(shù)顯示，LFT/S-MN+US組菌落形成最少，表明其體內(nèi)抗菌活性更強(qiáng)（圖5F）。到第9天，LFT/S-MN+US處理的小鼠傷口愈合率很高，組織再生明顯（圖5C）。在整個(gè)治療過(guò)程中，體重監(jiān)測(cè)顯示各組之間沒(méi)有明顯的波動(dòng)（圖5D），表明MN貼片具有良好的全身生物相容性。綜上所述，這些結(jié)果表明，LFT/S-MN與超聲結(jié)合，可以有效地消除細(xì)菌感染并顯著加速體內(nèi)傷口愈合。

圖5. LFT/S-MN貼劑的體內(nèi)抗菌效果和傷口愈合性能。（A）銅綠假單胞菌感染小鼠傷口模型的示意圖和使用MN貼片加或不加US刺激的治療策略。（B）處理后第0、1、3、5和9天傷口部位的代表性照片。黑色虛線圈表示初始傷口邊界。（C）各治療組傷口愈合隨時(shí)間的定量分析（n = 5）。（D）治療期間小鼠體重監(jiān)測(cè)（n = 5）。（E）各組第3天傷口床培養(yǎng)細(xì)菌菌落的瓊脂板照片。（F）基于菌落形成單位（CFU）分析的細(xì)菌活力量化（n = 3）。數(shù)據(jù)以mean ± SD表示。*** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示無(wú)顯著性。

結(jié)論：此研究成功開(kāi)發(fā)了一種pH響應(yīng)的雙層微針貼片（LFT/S-MN），通過(guò)整合超聲激活的協(xié)同抗菌療法（CDT/SDT）與酸性微環(huán)境觸發(fā)的免疫調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)感染傷口的高效治療。該貼片不僅能快速釋放靶向細(xì)菌的LFT NPs，在超聲下產(chǎn)生大量ROS以清除細(xì)菌和生物膜，還能在傷口酸性條件下持續(xù)釋放SPD，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，抑制過(guò)度炎癥。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該策略能顯著加速傷口閉合，促進(jìn)組織再生，且具有優(yōu)異的生物安全性。該工作為非抗生素依賴的感染傷口治療與組織再生提供了一種具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的新策略。